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FSHW | 为苹果酸乳酸发酵保驾护航——希氏乳杆菌Q19的耐乙醇机制研究

IntroductionETF

在葡萄酒酿造过程中，酒精发酵将葡萄果实中的糖转化为乙醇，而由乳酸菌介导的苹果酸-乳酸发酵（malolactic fermentation，MLF）通常在酒精发酵之后进行。目前，全球变暖引起葡萄果实中糖含量升高，葡萄酒中的酒精含量也相应上升，高浓度酒精对MLF中乳酸菌的生长造成严重威胁。乙醇侵入细胞膜后，可通过改变膜结构和破坏膜完整性，影响细菌代谢过程中关键酶的正常功能。

希氏乳杆菌（Lentilactobacillus hilgardii, L. hilgardii） Q19是一株从宁夏葡萄酒产区分离并纯化得到的本土乳酸菌菌株，该菌株对逆境条件表现出显著的耐受性，其可耐受19%（V/V）的乙醇浓度，明显高于商业苹果酸-乳酸菌（约15%（V/V））。此外，由L. hilgardii Q19发酵所获得的葡萄酒在香气种类和含量上均显著优于商业对照。因此，L. hilgardii Q19可被视为高酒精葡萄酒中新一代苹果酸-乳酸发酵剂的潜在候选菌株。基于其对高浓度乙醇的显著适应性，推测L. hilgardii Q19可能具备独特的生理机制以减少乙醇带来的细胞损伤。然而，其耐乙醇的复杂机制目前仍不清楚。因此，阐明L. hilgardii Q19在乙醇胁迫条件下的应对机制，对于深入理解微生物逆境响应机制及构建耐胁迫菌株具有重要意义。

在本研究中，宁夏大学葡萄酒与园艺学院金刚教授团队结合表型分析与转录组分析，对参与乙醇胁迫响应的关键代谢通路及相关基因进行了挖掘，并对部分基因功能进行了初步验证，以阐明其在乙醇耐受性中的作用。转录组分析筛选得到的主要代谢通路为乳酸菌抗逆性研究提供了明确的研究方向。同时，借助遗传工程手段构建耐胁迫菌株，有望进一步提高不利条件下苹果酸-乳酸发酵的效率。该研究不仅系统揭示了L. hilgardii Q19应对乙醇胁迫的分子机制，也为提升乳酸菌的乙醇耐受能力提供了重要理论依据。

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Results and Discussion

理化指标分析

综合对L. hilgardii Q19理化指标的分析表明，在乙醇胁迫条件下，该菌株的细胞膜流动性降低，物质交换能力减弱，这是大多数乳酸菌应对环境胁迫的共同特征。与此同时，乙醇胁迫显著促进了细胞对谷胱甘肽的摄取，增强了胞内ROS的清除能力，减轻了氧化损伤。这可能是L. hilgardii Q19能够良好耐受19%（V/V）乙醇胁迫的主要原因。

图1 乙醇胁迫条件下（A）L. hilgardii Q19的H+-ATP 酶活性。（B）L. hilgardii Q19的Na+/K+-ATP酶活性。（C）L. hilgardii Q19的Ca2+/Mg2+-ATP 酶活性。（D）L. hilgardii Q19的超氧化物歧化酶活性。（E）L. hilgardii Q19的细胞内谷胱甘肽含量。（F）L. hilgardii Q19的细胞内活性氧（ROS）含量。（G）L. hilgardii Q19的细胞膜流动性。（H）L. hilgardii Q19的细胞膜完整性。

关键代谢通路分析

差异表达基因的GO注释分析

转录组数据分析表明，在19%（V/V）乙醇胁迫条件下，与无胁迫环境相比，L. hilgardii Q19共检测到1 347 个差异表达基因，其中680 个基因显著上调，667 个基因显著下调（图 2）。

图2 0%和19%乙醇胁迫条件下L. hilgardii Q19 基因表达火山图

对上调差异表达基因进行GO富集分析发现，其显著富集于核糖体结构组成、核糖核蛋白复合物、细胞蛋白质代谢过程、蛋白质代谢过程以及酰胺类生物合成过程。这些结果表明，在乙醇胁迫条件下，L. hilgardii Q19通过增强蛋白质合成与代谢相关过程，以维持细胞基本生理功能和适应胁迫环境。下调差异表达基因主要富集于半乳糖苷酶活性、细胞骨架结构组成、碳水化合物代谢过程以及蛋白–脂质复合物相关功能（图3），表明乙醇胁迫对菌株的碳源利用能力、细胞结构维持及能量代谢过程产生了一定的抑制作用。

图3 Gene Ontology（GO）富集分析。纵坐标表示GO富集程度，横坐标表示差异表达基因的数量。(A) 上调表达基因；(B) 下调表达基因。

差异表达基因的KEGG通路分析

L.hilgardii Q19对乙醇胁迫的响应涉及多层次、多通路的协同调控，而非单一基因的简单调节。KEGG通路富集分析结果（图 4）显示，差异表达基因主要富集于以下关键代谢与调控通路：ABC 转运系统（Ibr02010）、磷酸戊糖途径（Ibr00030）、双组分系统（02020）、精氨酸和脯氨酸代谢（00330）、谷胱甘肽代谢（00480）以及丙酮酸代谢（Ibr00620）。

图4 KEGG通路富集分析。(A) 上调表达基因；(B) 下调表达基因。

这些通路共同参与了物质转运、能量代谢、氧化还原平衡以及环境信号感知与应答过程，表明L. hilgardii Q19通过调节多种代谢网络和信号转导系统，以增强其在乙醇胁迫条件下的适应能力与存活能力。

关键基因的功能验证

作为微生物生命活动的重要碳源，糖类的合成和代谢影响着主要的能源供应。脂质的合成和代谢主要影响细胞壁和细胞膜的形成。因此，进一步研究了与糖异生和脂质代谢相关的关键基因，包括pyk、gntK和glpK。

图5 L. hilgardii Q19过表达菌株的构建

结果表明，pyk基因在较低乙醇浓度（4%、8%（V/V））下对菌株存活有积极影响，而gntK和glpK基因在较高乙醇浓度（12%、14%（V/V））下对菌株存活有积极影响。

图6 乙醇胁迫下L. hilgardii Q19过表达菌株的存活率

第一作者简介

孙静娴，女，宁夏大学葡萄酒与园艺学院2020级硕士研究生。主要研究方向为葡萄酒化学与酿造工艺。硕士在读期间荣获“2022-2023学年研究生国家奖学金”、“2020-2021学年硕士研究生三等学业奖学金”、“2022-2023学年硕士研究生三等学业奖学金”、“优秀生源地奖学金”等荣誉。

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刘晓文，女，宁夏大学葡萄酒与园艺学院2022级硕士研究生，主要研究方向为葡萄酒微生物。硕士在读期间荣获“2024年研究生国家奖学金”、“2022-2023学年硕士研究生三等学业奖学金”、“第九届“互联网+”大学生创新创业大赛宁夏赛区银奖”等荣誉。

通信作者简介

金刚，男，准聘教授，博士生导师，宁夏青年科技人才托举工程人选，西北农林科技大学和澳大利亚阿德莱德大学联合培养博士（2012.2-2014.7受国家留学基金委资助赴阿德莱德大学联合培养学习）。主要研究方向为发酵及酿酒微生物、葡萄酒、果酒工艺创新。现任葡萄与葡萄酒工程专业负责人、葡萄与葡萄酒教育部工程研究中心副主任、兼任《农业科学研究》副主编，食品科学、《Food Chemistry》、《Food Control》等多个杂志审稿人，发表学术论文50余篇，获批发明专利2 项，出版专著1 部。近年来主持自治区级教学改革项目2 项，校级教改项目1 项，主持国家自然科学基金、自治区重点研发计划项目、宁夏自然科学基金等10余项。建立了贺兰山东麓产区苹果酸-乳酸发酵细菌菌种资源库，筛选优良菌种10余株，开发出了直投式苹果酸-乳酸发酵剂3 种。

Physiological and transcriptomic insights into ethanol stress tolerance in Lentilactobacillus hilgardii Q19

Jinxian Suna,b,1, Xiaowen Liua,b,1, Luqiang Huangc, Wen Maa,b, Gang Jina,b,*

aCollege of Enology and Horticulture, Ningxia University, Yinchuan 750021, China

bEngineering Research Center of Grape and Wine, Ministry of Education, Yinchuan 750021, China

cCollege of Life Science, Fujian Normal University, Fuzhou 350117, China

1 These authors contributed equally to this work.

*Corresponding author.

Abstract

Malolactic fermentation, started by lactic acid bacteria, plays a crucial role in the production of high-quality wines. As global warming increases the ethanol content in wines, the success of malolactic fermentation depends on selecting ethanol-tolerant strains, especially for wines from increasingly warm climates. Lentilactobacillus hilgardii Q19 was isolated and characterized as an indigenous malolactic bacterium with higher ethanol tolerance properties. In this study, it was indicated that ethanol stress had significant effects on ATPase activity, antioxidant system, and cell membrane of L. hilgardii Q19 by measuring the physiological indicators under stress which include H+-ATPase, Na+/K+-ATPase, Ca2+/Mg2+-ATPase activity, glutathione content, superoxide dismutase (SOD) activity and intracellular reactive oxygen species (ROS) content. The main metabolic pathways involved in ethanol stress such as ATP-binding cassette (ABC) transporters, pentose phosphate pathway, phosphotransferase system, glutathione metabolic pathway and two-component systems were screened by transcriptome sequencing analysis. The functions of the pentose phosphate pathway, pyruvate metabolic pathway and glycerolipid metabolism under ethanol stress were verified by constructing the L. hilgardii Q19 ethanol stress related key genes gntK, pyk, and glpK overexpression vectors. The above findings may contribute to our understanding of the metabolic pathways and regulatory mechanisms of L. hilgardii Q19 in response to ethanol stress.

Reference:

SUN J X, LIU X W, HUANG L Q, et al. Physiological and transcriptomic insights into ethanol stress tolerance in Lentilactobacillus hilgardii Q19[J]. Food Science and Human Wellness, 2026, 15(2): 9250361. DOI:10.26599/FSHW.2024.9250361.